令人起疑的是，夏洛特身上出现的咬痕成为了解开谜团的关键线索。众所周知，无论是魟还是鲨鱼，它们均采用体内受精的方式繁殖，其中雄性鲨鱼会在交配过程中咬住雌性的鳃部皮肤以固定位置完成受精过程。鉴于此，工作人员推测，夏洛特身上的咬痕可能是由同缸的条纹斑竹鲨所造成。
然而，莫特海洋实验室和水族馆鲨鱼研究中心主任、科学家迪米安·查普曼对此提出了否定观点。他指出，由于刺魟与鲨鱼之间存在着生殖隔离机制，两者无法进行有效繁殖。尽管魟、鳐、蝠鲼与鲨鱼同属软骨鱼纲，但前者属于下孔总目，后者则属于侧孔总目，主要区别在于它们鳃裂的位置——前者的鳃裂位于腹部，后者的鳃裂则分布于身体两侧。迄今为止，在全球范围内尚未有任何关于魟、鳐或蝠鲼与鲨鱼成功交配并诞下后代的记录。
既然排除了鲨鱼致使夏洛特怀孕的可能性，那么她究竟是如何实现怀孕的呢？查普曼及众多科学家一致倾向于一种极为罕见且神秘的生命繁衍方式——孤雌生殖。这是一种不需要雄性参与，仅依靠雌性自身就能够产卵并孵化出后代的无性生殖现象。
脊椎动物中约有70种物种具备孤雌生殖的能力，涵盖爬行动物、鸟类以及鱼类等类别。在孤雌生殖的过程中，卵细胞中的DNA复制一次，经历两次减数分裂后形成4个卵原细胞，原本应当被吸收的三个卵原细胞之一，却能与剩下的一个结合，从而生成类似于受精卵的胚胎，进而发育成成熟的个体。事实上，豹纹鲨、肩章鲨、窄头双髻鲨等已有多例孤雌生殖的成功案例，甚至悉尼海洋生物水族馆的一条纳氏鹞鲼——作为刺魟的近亲——也曾有过孤雌生殖的纪录。因此，在综合考虑以上科研认知和历史记录的基础上，科学家们认为，刺魟夏洛特的怀孕方式极有可能是通过孤雌生殖实现的。至于真相究竟如何，唯有等到幼鱼降生之后，才能揭晓这个扣人心弦的生命奥秘。
